中国国际啤酒网友情提示：该篇文章在“中国啤酒国庆60周年征文”中荣获二等奖，在此向北京燕京啤酒集团公司技术中心的郭立芸、周青梅、孙金兰、林智平和贾凤超作者表示祝贺！
摘要：在啤酒大麦国产化的大趋势下，啤酒厂如何采购并使用好国麦是关键问题，以克服国产大麦的浸出率低、质量不稳定、加工困难、加工成本高，品种纯度和质量均一性差的缺点，就要求有一套完整的体系去评价国产大麦和麦芽的质量。本文利用近红外技术和快速粘度分析法建立一套快速、准确地评价大麦水分、蛋白质和发芽率的新方法，实现对大麦的快速、环保、大批量检测，以解决国产大麦进货检验和生产控制的需求。开发了准确性高的大麦品种真实性和纯度检验方法，构建燕京啤酒大麦标准蛋白质“指纹”图谱库，以应用于进口大麦及国产大麦的品种和纯度的鉴定中对公司的大麦原料采购、生产使用将起到重大的指导作用。研究了国产大麦的DON、黄曲霉毒素B1和霉菌等安全性指标，建立和完善了啤酒大麦/麦芽质量安全评价体系。
关键词：快速发芽率 品种和纯度“指纹”图谱 毒素 质量安全评价体系
中国是世界第一大啤酒生产国，但始终没有摆脱啤酒大麦依赖进口的局势。长期以来，中国啤酒大麦依赖于进口，进口价格曾一路飙升到480美元/吨。在巨大的原料成本压力下，啤酒行业似乎经历了一场以“成本-质量”为核心的工艺革命：啤酒厂面对进口大麦与国产大麦的博弈，面对国家对啤酒酿造及质量的新标准、新要求，应该如何应对？需要我们认真思考。无论如何，企业最终是要赢利的，而产品质量是决定企业是否具备持续赢利能力的重要因素。打造以产品质量，包括食品安全为核心的管理机制，是企业基业长青的坚实基础。从产品质量的稳定与提高方面讲，大麦质量无疑占有非常高的地位。
2007年，进口啤酒大麦数量锐减，给国产大麦发展带来了契机，但是国产啤酒大麦存在着浸出率低、质量不稳定、加工困难、加工成本高，品种纯度和质量均一性差，给制麦和酿造工艺控制带来一定困难。首先，传统的检测方法检测时间长、操作繁琐、环境污染大，给国产大麦的使用带来许多困难。面对国内啤酒大麦的种植与流通方式的差异，大麦品质参差不齐，对检验的频次和检验速度都提出了更高的要求。衡量大麦品质的主要指标有蛋白、水分、发芽率等，由于现有分析方法操作步骤繁琐、耗时长且环境污染大，往往无法及时、大批量地进行检测，造成对大麦质量评价的不及时、不全面，给进货或生产带来许多困难。要求有一种新的快速分析方法以实现快速、大批量的检测目的，以解决进货检验和生产控制的需求。其次，国产大麦品种纯度和质量均一性差，给制麦和酿造工艺控制带来一定困难。在中国啤酒大麦的质量管理体系没有健全之前，啤酒厂如何采购到优质国麦是核心问题。面对国产大麦品种纯度和质量均一性差，给制麦和酿造工艺控制带来的困难。因为大麦受品种遗传特性的影响，始终会保留一些品种特性。品种对大麦酿造特性的影响非常明显。因此建立大麦国产大麦品种的蛋白质“指纹”图谱，就显得尤其重要。再次，真菌毒素的研究仅限于黄曲霉毒素[1]。啤酒从大麦到成品的整个生产环节中,可能存在有害的真菌毒素。国外对真菌毒素的研究始于世纪年代末,在真菌毒素的产生、预防、检测及法规标准制定等方面进行了广泛深人的研究。我国近年来加强了食品安全性研究,但在啤酒行业,仅有黄曲霉毒素这一种真菌毒素的标准。真菌毒素作为农产品的天然污染物,在加工过程中形成或遗留的毒素有可能会被带到啤酒中，由于真菌毒素对人类的危害性,使之成为啤酒质量安全性关注的重点之一。
从行业发展的角度上讲，啤酒大麦国产化还是大趋势，啤酒厂如何采购和使用好国麦是关键问题。这就要求有一套完整的体系去评价国产大麦和麦芽的质量。为此我们利用近红外技术和快速粘度分析法建立一套快速、准确地评价大麦质量的新方法，实现对大麦的快速、环保、大批量检测，以解决国产大麦进货检验和生产控制的需求。开发了准确性高的大麦品种真实性和纯度检验方法，构建燕京啤酒大麦标准蛋白质“指纹”图谱库，以应用于进口大麦及国产大麦的品种和纯度的鉴定中对公司的大麦原料采购、生产使用将起到重大的指导作用。建立和完善了啤酒大麦/麦芽质量安全评价体系。
1大麦快速检测体系的研究
目前使用的蛋白质分析法主要是凯式定氮法，所需的催化剂、浓酸、浓碱对环境的污染都较大，且成本较高，对于啤酒厂而言，每年此项目的分析费用近万元，近红外分析法，不需任何化学药品且仪器消耗低，还可同时检测水份的结果，大大缩短检测时间。在日益严格的市场经济环境下，利用近红外光谱仪分析速度快、操作简便，消耗成本低的特点，对啤酒大麦进行快速准确的检测，有利于降低分析成本，提高检测速度。我们通过对国产大麦建立相应的近红外应用模型解决了大麦蛋白质和水份的快速检测。通过研究啤酒大麦糊化参数和发芽率之间的相关性，开发了粘度法快速检测大麦发芽率的方法。
1.1近红外法检测大麦蛋白质、水份的研究[2]
近红外光谱的分析是一种间接的分析技术，它是将样品的近红外光谱和用标准法分析的数据进行关联，用化学计量软件进行回归计算，建立校正模型。目前近红外技术本身可以说比较成熟了，但支撑近红外应用的各种技术平台和标准体系尚未建立健全。通俗地说，作为一个企业或一个使用者，可以花钱买到近红外光谱仪以及相关的分析软件，但买不到各种具体指标的检测模型。因此要真正使用近红外技术，必须要首先研究建立各种检测模型。一般过程如下：
(1)确定检测目标(物质须含有C-H、O-H、S-H、N-H等官能团，检测目标与它们有直接或间接关系)；(2)系统收集有代表性的标样；(3)用经典方法测定标样指标值；(4)用近红外光谱仪扫描标样，用计量化学分析软件研究光谱与目标值间的关系，建立相应的检测模型；(5)与经典方法进行平行比对，对模型进行验证、优化模型直至达到精度要求；(6)检测模型投入应用，同时在使用过程中不断补充、优化和维护模型。
我们对搜集的150个大麦样品，以凯氏定氮法为比对方法，利用WINISI Ⅲ，V1.50软件进行光谱分析和回归处理，对光谱进行一阶导数处理，采用偏最小二乘法建立了近红外光谱技术定量分析大麦水份和蛋白质的应用模型，其模型的相关系数见表1。
所建模型的内部交叉验证预测值和理论值之间的决定系数分别为0.9654，0.9467，相应标准差为0.02，0.03。说明模型具有很好的稳定性和准确性。以凯氏定氮测定结果为标准值，利用近红外谷物分析仪测定60个不同大麦的水份和蛋白质，结果发现近红外光谱法测定结果与凯氏定氮法的相关性分别为0.9558，0.9418，说明近红外法检测大麦蛋白质和水份都具有极高的准确性。完全可用近红外法代替传统的方法进行大麦蛋白质和水份的检测。
1.2快速粘度法检测大麦发芽率的研究
使用快速粘度测定仪(RVA)，用特定的分析程序，得到大麦糊化曲线。通过粘度曲线确定其峰值粘度、峰值时间、衰减度、峰面积、保持时间和最终粘度等参数。采用多元逐步回归技术，将这些参数作为独立变量和大麦发芽率建立回归模型。然后，在同样条件下用已建立的回归模型预测大麦发芽率。图1为淀粉的特征糊化曲线，图2为不同大麦的糊化粘度图。
糊化温度，Pasting Temperature：淀 粉加热至某一温度时，试样的粘度迅速增加表示淀粉开始糊化。 峰值粘度，Peak Viscosity：淀粉在高温处理下，其粘度也将达到最大值就为峰值粘度。 保持粘度，Holding Strength：在糊化特性曲线中表现的一个峰和一个谷，谷底的粘度就是保持粘度。 最终粘度，Final Viscosity：在测试的末端，试样表现粘度增加到某一个相对的稳定值，定义为最终粘度。 崩解值，Breakdown：定义峰值粘度和保持粘度的差值为衰减度。 回生值，Setback：最终粘度和保持粘度的差值为回生值。
从图2可看出，不同发芽率的大麦样品的峰值粘度、峰值时间、衰减度、峰面积、保持时间和最终粘度都有所不同。糊化曲线的主要几个参数范围分别为：峰值粘度的范围为233—6031cP，糊化温度为67.25-81.7℃，回生值为15-979cP。由此可见，国内大麦糊化特性差异明显。导致该差异的因素很多，品种的差异、收获时的天气、晾晒的条件、休眠期等都会对大麦的糊化曲线产生影响。因此在建立大麦发芽率的预测模型不能简单的用某一个参数进行回归，需要综合考虑所有的糊化参数指标及权重。
采用The Unscrambler 9.8软件提供的多元逐步分析法建立大麦发芽率与RVA参数间的回归模型，其模型结果如下：
Y=-276.071029+0.429018416*X8+0.666322608*X7-160.8015438*X4+27.54148456*X6+243.2166056*LNX5-1539.296711*LNX4-0.00001258777921*X3*X3+0.000135706524*X7*FX7-0.407068787*X6*X6+0.0000416086343*X1*X3-0.0000375934431*X1*X7-0.00000861838841*X1*X5-0.0000869005732*X2*X7+0.2036248525*X3*X4+0.0802227957*X8*LNX5-1.34744168*X8*LNX4+0.0000086198053*X3*X5+0.02616626979*X3*LNX4+0.00000676570953*X7*X5-0.0883667455*X7*LNX5+0.000047967762*X6*X5-3.95636484*X6* LNX5 +35.2912743*X6* LNX4
其中，Y为大麦发芽率，X1为峰值粘度，X2为保持粘度，X3为最终粘度，X4为峰值时间，X5为峰值积分面积，X6为糊化温度，X7为回生值，X8为崩解值。
对建立模型的准确性进行评价，用建立的回归模型对样品进行预测并与国标法进行对比，计算其相关系数及标准差（见图3）。
图3 RVA仪器快速法和国标法测定大麦发芽率间结果比较
从图3可看出相关系数为0.85，说明大麦的粘度参数与大麦发芽能力有很好的相关性，可通过分析大麦粘度曲线各参数的情况来预测大麦的发芽能力。
采用近红外法与快速粘度法，建立的大麦快速检测体系，实现大麦的快速、大批量检测。
传统的检测方法，大麦蛋白质的检测每个样品需要5-6h，水份需要3-4h，发芽率需要120h。快速检测体系的建立使蛋白质和水份的检测缩短到2min，发芽率的检测缩短至15min，大大缩短了检测时间，且使检测实现仪器化，减少了化学试剂的使用，大大降低了检测成本，保护了环境。为企业使用国产大麦提供充分的数据保证，起到了很好的经济效益和环保效益。
2利用蛋白质“指纹”图谱技术鉴定大麦品种和纯度的研究[3]
现在国内外发展建立了多种生物化学及分子生物学方法对大麦品种和纯度进行鉴定，其中主要采用的是大麦醇溶蛋白电泳法。醇溶蛋白属于贮存蛋白，存在于大麦的淀粉胚乳层中。占成熟种子蛋白质含量的40%-50%，具有特殊的溶解性质，可用乙醇-水混合溶液提取。Draper等通过实验，认为大麦种子醇溶蛋白的SDS-PAGE电泳图谱可作为品种的生化“指纹”，用于品种真实性和纯度的鉴定。
实验方案设计流程图
原料大麦样品——随机挑选100粒样品种粒，提取麦粒醇溶蛋白——通过SDS-PAGE电泳法（230mm×150mm）检测样品的纯度——选取非杂粒的麦粒醇溶蛋白样品——通过SDS-PAGE电泳法（80mm×80mm）检测样品的醇溶蛋白特征——建立每个原料大麦的品种和纯度标准“指纹”库——使用Gel-Pro3.2分析软件进行谱带分析——使用Cross Checher 2.8和MEGA 3软件进行聚类分析——制定原料大麦采购时的纯度及品种鉴定标准。
2.1原料大麦品种及纯度鉴定实验方法的开发与优化
2.1.1大麦醇溶蛋白的提取
取一粒大麦种子，碾碎，放入1.5ml的离心管中，每个离心管中分别加入0.5ml醇提取液，混合均匀。80℃水浴20min，3000r/min离心10min，取上清50μl，加入50μl提取液，混合均匀，做好标记后放入-20℃冰箱中保存备用
上样前，每支样品加入等体积上样缓冲液100μl，振荡混匀后放入沸水浴中煮沸3min。取出后放至室温，上样前振荡均匀后使用。
2.1.2、大麦纯度与品种检测方法的最佳条件
Tris-SDS-PAGE电泳体系检测大麦纯度与品种的最佳条件确见表2。
表2 大麦纯度与品种的最佳检测条件
2.1.3、图谱分析
1、大麦醇溶蛋白的分子量分区
使用Gel-Pro3.2分析软件进行谱带分析。根据电泳图谱和标准蛋白的分子量划分区间，可将被检测样品的醇溶蛋白分为A、B、C、D四个部分。A部分是分子量分布在60~94kDa的蛋白，B部分是分子量从45~60kDa的蛋白，C部分是分子量从26~45kDa的蛋白，D部分是分子量<26kDa的蛋白。从收集到的11个样品的蛋白图谱可以发现：大麦醇溶蛋白在A、D两个分子量区间上的蛋白条带数量少，且样品间的谱带无明显差异；大麦中的醇溶蛋白谱带主要集中在B、C两个部分，且这段区间上样品的蛋白谱带有其各自的特异性，利于分辨样品间的品种差异性。
2、大麦醇溶蛋白含量与分子量的关系
通过软件分析计算出大麦醇溶蛋白的分子量及其在相应分子量上的IOD值（每条蛋白谱带的OD值积分），将同属一个产地的大麦样品取其区间内IOD值的平均值，从而分析醇溶蛋白含量与分子量的关系见图4。
图4 不同大麦蛋白质和分子量的关系图
从图4中的蛋白含量分析发现：大麦醇溶蛋白在A、B部分的含量相对较少，其含量较多的成分主要集中在C、D两个区域。这是大麦醇溶蛋白的共同规律，虽然每个品种在四个区间上的蛋白含量及其分子量都各不相同，但他们都基本遵从这一共同规律。
3、大麦醇溶蛋白分子量的对应最大OD值分析
以不同产地大麦的分子量及其对应的最大OD值作图，可以清晰地看出彼此之间的差异。
图5 不同大麦的最大OD值对比图
从图5可以看出，澳洲大麦均在分子量为50kDa和37kDa的位置有OD值〉0.15深色谱带；国产大麦在分子量为40kDa和30kDa的位置上有OD值〉0.23的深色谱带。加拿大大麦在分子量从29~50kDa之间有5条连续的强蛋白谱带，其OD值比为0.14:0.20:0.31:0.36:0.26，与其它产地的大麦相比有明显的特征性。这些表象可以作为判定大麦产地的特征性标志。
2.2建立国产大麦标准蛋白质“指纹”图谱数据库
国产大麦数据库：甘啤、盐啤、临啤、垦啤、苏啤、东北大麦、科隆大麦、凤大麦、鄂大麦、新疆大麦、杨农啤、驻啤、甘3、宁夏大麦和单二大麦。电泳图谱见图6
图6 不同国产大麦的电泳图谱
2.3建立国产大麦的采购标准
将构建的原料大麦标准蛋白质“指纹”数据库应用于国产大麦的采购中，制定出国产大麦采购的检测方法和质量判定标准。
纯度检测：样品纯度>90%
品种检测：醇溶蛋白特性与相应品种标准蛋白性质吻合，且遗传特性稳定
