中国国际啤酒网友情提示：该篇文章在“中国啤酒国庆60周年征文”中荣获二等奖，在此向青岛啤酒股份有限公司科研中心的田玉红、郝俊光、张宇昕、单连菊和董建军作者表示祝贺！
摘要：本文关注了评价啤酒风味稳定性指标的研究进展，综合比较几种老化指标和抗氧化指标及其测定方法在啤酒新鲜度测定中的应用，并将各指标的测定结果与专家评委的品评结果作分析，初步对几种方法进行了评价。确立了利用ESR测定啤酒的Lag Time来表征啤酒的新鲜度以及预计啤酒的货架保质期。该指标与啤酒新鲜度之间有良好的相关性，相关系数高达0.6。
关键词：啤酒，风味稳定性，ESR，Lag Time，新鲜度
啤酒作为一种大众性的饮料酒，其品质指标是各大啤酒公司的核心竞争力。作为一种含有多种无机及有机物质的复杂体系，啤酒的风味稳定性一直受到厂家及消费者的关注。感官品评能直接描述啤酒的风味，是啤酒品质的最基本、最有效的评价指标，但是感官评价因人而异，受个体因素影响较大，存在较大的误差。用化学分析方法来定量研究啤酒的抗氧化和老化机理，评价啤酒的风味稳定性是啤酒研究中的重点关注方向。国内外对啤酒老化的研究已经取得了一定的进展和突破，但由于啤酒体系及其老化反应的复杂性，啤酒的老化机理仍在不断的探索中。
成品啤酒的风味是从新鲜到老化的动态过程，啤酒的老化物质的出现，与啤酒的氧化紧密相关。啤酒生产从制麦到成品的过程中形成大量的老化物质的前驱体，如杂醇、不饱和脂肪酸、还原糖等，以及一些影响风味老化进行的物质如类黑素、多酚等，它们在老化过程中并行反应，形成羰基化合物和其它一些影响风味的物质[1] [2]，最终使啤酒呈现老化味。由于这种变化主要是由啤酒风味物质不断氧化引起，所以称为“氧化味”或“老化味”[3][4]。新鲜啤酒中含有一定量的内源性抗氧化物质，如二氧化硫、抗氧化的酚类化合物（类黄酮，花色素，黄烷醇）、类黑素、Vc、谷光甘肽等[5]，自身具有一定的抗氧化能力。对啤酒的抗氧化能力的测定，能在一定程度上评价啤酒的新鲜度以及预测啤酒的货架保质期。
基于啤酒风味稳定性的重要性，本文关注了其评价指标的研究进展，综合比较几种老化指标和抗氧化指标及其测定方法在啤酒新鲜度测定中的应用，并将各指标的测定结果与专家评委的品评结果作分析，初步对几种方法进行了评价。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
啤酒，市售商品啤酒。2，2’-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐（ABTS），2,2'-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐（AAPH），抗坏血酸钠（Vc钠），二苯代苦味酰肼（DPPH），硫代巴比妥酸，N-叔丁基苯硝酮（PBN），5-羟甲基糠醛（5-HMF），三氟乙酸均购自Sigma-Fluka公司。无水乙醇、醋酸、醋酸钠、氯化汞、氯化钠、磷酸、硫酸、乙腈等均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器和设备
纯水仪,Milli-Q Plus；恒温水浴，宁波天恒仪器厂THD-0515W；分光光度计，Amersham Biosciences Ultrospec 2100pro型；pH计，Mettler ToleDo Delta 320；高效液相色谱仪，Waters 2695； 二极管阵列检测器，Waters 2996；涡旋混匀器，IKA MS 3basic；ESR(electron spin resonance)电子自旋共振仪,德国，Bruker 公司，软件：Bruker ELBA for e-scan；PE Clarus AutoSystem XL色谱仪，Turbomatrix 40 headspace进样器；Agilent DB-5毛细管色谱柱。
1.3 测定方法
1.3.1 TBA值测定[6]
羰基化合物被认为是啤酒老化过程中的最重要的物质,针对该类物质的检测主要是TBA法,其原理是利用乙酸化的硫代巴比妥酸与羰基类化合物反应形成生色团,测定其吸光度,数值越高啤酒的老化程度越重。
其检测方法为：7mL啤酒在10000r/min下离心10min后，弃去沉淀物，取5mL离心后的啤酒，加入2mL含0.33 %硫代巴比妥酸的50 %乙酸溶液，混匀后于 60℃水浴中精确加热60min，速冷。以5mL离心后的啤酒加 2mL蒸馏水为空白，530nm下吸光度即为TBA值。
1.3.2 DPPH清除率的测定[7]
二苯代苦味酰肼（DPPH）是一种稳定的自由基，在517nm处有强吸收。当啤酒中的还原性物质存在时，DPPH被消耗。利用比色法可以检测自由基清除情况，从而评价样品的抗氧化能力。
检测方法为：，制备摩尔浓度为1.4*10-4mol/L的 DPPH无水乙醇溶液。将待测酒液用水稀释10倍备用。将2 mL待测液及2 ml DPPH溶液置于一具塞试管中，混匀，室温下放置30min，以无水乙醇为空白。在517nm波长下，测定样品及空白的吸光度A，并以下式计算清除率：
式中 Ac：2 ml无水乙醇加2 ml DPPH溶液的吸光度
Ai：2 ml待测液加2 ml DPPH溶液的吸光度
Aj：2 ml待测液加2 ml无水乙醇的吸光度
1.3.3 TRAP值的测定[8]
ABTS（2，2’-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐）是一种显色剂，在过氧化自由基引发剂AAPH（2,2'-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐）的作用下，可定量生成稳定的ABTS自由基，反应混合液呈蓝色，在734nm处存在强吸收。啤酒中的抗氧化物质与自由基作用后会使反应混合液颜色变浅，利用比色法可以测定自由基清除情况，从而评价啤酒的抗氧化能力。以抗坏血酸盐为标准参照物，可以定量测定啤酒的总抗氧化值，即TRAP值（Total Reactive Antioxidant Potential）。TRAP值越高，啤酒的抗氧化能力越强。
检测方法为：制备含有75μmol/LABTS和2mmol/L AAPH的50mmol/L醋酸盐缓冲液的混合液。把混合液置于45℃水浴中反应60min，然后冷却至室温备用。取80μl样品加入到5ml上述混合液中,25℃水浴保温15min, 在734nm下比色。以50mmol/L醋酸缓冲液作空白,以1mmol/L抗坏血酸盐溶液作标准参照。以下式计算TRAP值
注：C为抗坏血酸盐浓度；
A为吸光值；
TRAP表示相当于多少mmol/L抗坏血酸盐
1.3.4 5-羟甲基糠醛的测定[9]
5-羟甲基糠醛（5-HMF）是啤酒中主要风味老化物质的代表，其水平高低与啤酒存储期间的老化程度存在一定的相关性。
5-HMF的检测方法为：啤酒震荡除气后，经0.22um滤膜过滤。色谱条件：色谱柱:Atlantis C18 5μm（4.6×250mm），检测波长280nm；柱温：30℃；Waters 2695高校液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器。采用梯度洗脱，流动相为0.01%三氟乙酸水溶液和乙腈。
1.3.5 Lag Time的测定[10-15]
Lag Time 是利用电子自旋共振技术（Electron Spin Resonance，ESR），在自由基捕捉技术基础上，通过对特定条件下自由基的检测来反映啤酒抗氧化能力。新鲜啤酒中含有内源性抗氧化物质，如二氧化硫、抗氧化的酚类化合物（类黄酮，花色素，黄烷醇）、类黑素、Vc、谷光甘肽等，随着老化的进程，抗氧化物质逐渐被消耗尽，自由基开始被PBN捕获并被ESR检测到。自由基从少量被检测到转变成大量产生的拐点对应的时间就是Lag Time，其值表达了啤酒的内源抗氧化活力EAP，从而决定了啤酒的风味稳定时间。
检测方法为：啤酒经离心除气，5500rpm，5 min。取9.5ml除气啤酒于棕色样品瓶中，加入0.5ml 1mol/L PBN乙醇溶液，涡旋混匀器加速混匀。用Bruker ELBA for e-scan设置检测顺序和调用方法，进行检测。ESR条件：机械浴温度：60℃；中心磁场: 3465G；扫描宽度：20G；微波功率：4.33MW；放大倍数：2.51*102；调制频率：86kHz；调制幅度：2.0G；采集次数：4times；数据处理方式：S拟合。
1.3.6 二氧化硫的测定[16-18]
二氧化硫是啤酒中的主要抗氧化物质之一，是相当强的还原剂，是活性氧自由基的强大受体，在啤酒的pH值范围内比多酚的抗氧化性能更好，其与羰基结合还能掩盖啤酒的老化味，是保持啤酒新鲜最重要的因素。二氧化硫在啤酒中可分为游离二氧化硫和总二氧化硫，可分别进行测定。
游离二氧化硫的检测方法为：取5ml除气后的样品，加入配制好的稀磷酸（85%的浓磷酸经四倍稀释）5ml，密封。GC条件：PE Clarus AutoSystem XL色谱仪，Turbomatrix 40 headspace进样器，FPD检测器检测，Agilent DB-5毛细管色谱柱。进样口温度150℃，载气25psi，检测器温度250℃，柱箱温度50℃保持3分钟，然后升温到200℃，最后回到50℃。空气流量为105ml/min，氢气为90ml/min，通过标准曲线定量。
总二氧化硫的检测方法为：配制含有0.1mol/LHgCl和0.2mol/LNaCl的汞稳定液。吸取该稳定液2ml和0.05mol/L硫酸溶液5ml于100ml容量瓶中，准确量取冷的、未除气的待测啤酒样品10ml于容量瓶中，轻轻摇动混合，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液15ml，混匀，静置15s。再加0.05mol/L硫酸溶液10ml，用水定容至刻度，充分混匀，配成悬浊液。在GC顶空瓶中加入5ml的悬浊液样品，加入配制好的稀磷酸5ml，密封。GC条件：同上。