3大麦安全指标的检测方法的研究
我国近年来加强了食品安全的研究，但是在啤酒行业，还仅限于黄曲霉素毒素这一种真菌毒素的研究及标准。真菌毒素作为农产品的天然污染物，在种植、贮存和加工过程都可能产生，在制麦和酿造过程中一部分被破坏，但是在加工过程中形成或遗留的毒素有可能会被带到啤酒中，由于真菌毒素对人类的危害性, 使之成为啤酒质量安全性关注的重点之一。
3.1运用免疫亲和柱和高效液相色谱( HPLC) 检测啤酒大麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究[4]
脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (Deoxynivalenol ,DON) , DON 分子式为C15H20O6 ,分子量296.3 ,又叫呕吐毒素(Vomitoxin) ,自然界中广泛存在于小麦、大麦、玉米等粮谷类农作物中。可导致人的急性中毒,症状是胃部不适、恶心、呕吐、头痛、头晕、腹痛、腹泻。还有全身无力、口干、流涎等症状,少数患者有发烧、颜面潮红等症状,已被联合国粮农组织和世界卫生组织确定为最危险的自然发生食品污染物,其含量和危害性列入国际控制研究的优先地位。欧盟委员会规则EC1881/ 2006 号规定了谷物和谷物食品中DON的限量标准。啤酒大麦是啤酒酿造的主要原料,很容易感染DON ,制麦过程中,DON 会影响大麦发芽,使啤酒大麦的发芽率低于95%[5] ,导致产生的酶和浸出物减少。DON 还可能导致啤酒的喷涌,啤酒色泽的改变或产生臭味等。
3.1.1采样与提取
准确测定啤酒大麦中的DON 含量决定于多个因素,正确采样是首先应解决的问题。从尽可能多的位点采集,对于一堆货物,要根据要求,分别从里到外,从上到下各个部位取样,然后粉碎混合均匀,再从中取小部分用于实验。研磨采集的样品,但不要研成粉末,使粉碎样品的95 %通过20 目筛。称取25.00 g 至于三角瓶中,加入5 g 聚乙二醇8000 ( PEG) 和100 mL 的超纯水,放到超声波清洗器中均质1 h ,采用快速滤纸过滤,再用微纤维滤纸过滤,收集滤液。
3.1.2净化
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下。准确移取1 mL 上述滤液注入玻璃注射器中,将空气压力泵与玻璃注射器连接,调节压力使溶液以1 滴/ 秒流速缓慢通过免疫亲和柱,直至空气进入柱子。用5 mL 的超纯水以2 滴/ s 的流速快速冲洗柱子,直至空气进入柱子。加入1.5 mL 色谱级甲醇洗脱,流速为1滴/ s ,收集洗脱液于玻璃试管中,再用N2 在50 ℃下吹干。用0.25 mL 流动相定容,供液相色谱检测。
3.1.3色谱条件
色谱柱: ZORBAX SB - C18 柱( 416 mm ×250mm ,5 μm) ; 流动相: 甲醇2水( 20 ∶80) ; 流速: 110mL/ min ,进样量:20μL ;检测器:紫外检测器;检测波长:218 nm。
3.1.4 DON标准曲线
配制DON 标准液浓度分别为0.025 、0.050 、0.250 、0.500 、1.000 和2.000 mg/ L ,按上述实验条件处理进样,用所得峰面积对浓度进行回归分析,线性关系较好,回归曲线见图7。回归方程为y =-672.40+23532x ,R2=0.9994。
图7 标准曲线
3.1.5 实际样品的检测
分别对我国四大产区的啤酒大麦和国外进口大麦进行抽样检测,所测样品中的DON的含量其含量远远低于DON的限量标准。江浙、东北和云南产区大麦中的DON 含量较高一些，而西北产区、加拿大和澳洲大麦中的DON含量较低一些,主要原因可能是气候的原因，因为江浙、东北和云南地区气候较为湿润，有利于真菌的生长。而西北、加拿大和澳洲气候较为干燥。
3.2黄曲霉毒素B1的检测方法开发与研究
黄曲霉毒素是真菌毒素中毒性强、污染频率高的种类之一，黄曲霉毒素主要产生于农作物中，特别是粮食、饲料。通过各种实验证明黄曲霉毒素B1是已知各种真菌毒素中最稳定的一种，据调查，除粮食、饲料以外，在油作物、水果、乳和乳制品、发酵产品等都发现了不同程度的黄曲霉毒素B1及各种真菌毒素的污染。因此，我们重视这些有害物质的存在，加大监测力度，保证人类健康发展。
因此我们使用酶免疫法检测黄曲霉毒素B1含量的检测方法进行了研究。
3.2.1测定原理
测定的基础是抗原体反应。Aflaplate是直接竞争BLISA试剂盒，用甲醇水溶液从粉碎样品中提取黄曲霉毒素B1再过率。然后滤液中的毒素与酶标记物混合，混合后的溶液转移至保被了抗体的微孔中，游离的毒素与酶标记务竞争孔中的特异抗体。任何未连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。加底物到孔中并且孵育。颜色产生与样品中黄曲霉毒素B1数量成反比。加入反应停止液停止反应。样品中黄曲霉毒素B1的浓度可以从标准曲线上直接读得。
3.2.1样品提取
称取50克粉碎了的样品，4克氯化钠与250毫升60%的甲醇水溶液放入具有1升容量的均质器中，高速均质1min。用滤纸过滤提取物，收集少量滤液。
3.2.3按照酶联免疫试剂盒的使用说明在20-28℃条件下进行操作。
3.2.4计算结果
所获得的标准和样品吸光度值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100，因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。
计算的标准值绘成为一个对应黄曲霉毒素B1浓度（μg/Kg）的半对数坐标系统曲线图，相对应一个样品的浓度（μg/Kg）可以从标准曲线上读出。
3.2.4实际样品的检测
对国产甘啤、盐啤、临啤、垦啤、苏啤、东北大麦、科隆大麦、凤大麦、鄂大麦、新疆大麦、宁夏大麦和单二大麦等12个品种和进口大麦盖得那、宝黛、哈灵顿和艾斯特拉进行了黄曲霉毒素B1的检测，检测结果全部未检出。
3.3大麦中霉菌的检测与研究
3.3.1实验验方法
参照国标GB/T 7416-2000中大麦中霉菌数的检测方法对国麦进行检测。
3.3.2实际样品的检测
对2006-2007年进厂的大麦进行霉菌检测。整体检测情况表明进口大麦霉菌污染情况明显好于国产大麦，国产大麦中霉菌污染严重的是西北国麦，甘肃大麦等, 国产东北大麦霉菌污染都低于其它产地的国麦。大麦微生物污染情况可以通过辅助手段如样品的外观、气味等比较容易的判断出来。污染严重的大麦外观颜色发黄、暗淡、杂质较多，有的颜色较深，闻起来有霉味。因霉菌繁殖很快，在霉菌数量较多的情况下，7d观察结果霉菌菌落就会连成一片，也许会影响准确结果的记录，建议可提前1—2d观察一下霉菌菌落数。
4建立和完善啤酒大麦/麦芽质量安全体系
由于我国啤酒大麦是以千家万户小农经济兼业生产方式为主，大麦收获后不经过初选，且水分偏高，导致发芽率偏低，籽粒整齐度、均一性差，蛋白质含量不均一等，这使国产大麦储存困难，在制麦品质上表现为浸麦的吸水力，呼吸作用的强度和酶促反应的进程不均一，最终导致溶解不均匀，某些重要的麦芽品质指标不达标或有缺陷，增加了制麦的水耗与能耗，延长了制麦周期，降低了制成率，且增加了啤酒生产中许多环节的难度，最终影响啤酒质量。所以我们建立和完善了啤酒大麦/麦芽质量安全标体系。
4.1国产大麦主要理化标准及让步接收标准
表3 国产大麦主要理化指标与让步接收标准
4.2国产大麦的质量安全管理体系
4.2.1国产大麦水分的管理
针对国产大麦水分差异较大（10.6%～19%），我们将大麦水分分为：水分≤13%；13%＜水分≤14%；14%＜水分≤15%；水分≥15%四个区间，水分≤15%按水分区间进行码放储存，水分≥15%的国产大麦先进性晾晒，待水分≤13%后再进行码垛。码垛时采用了网格式码放，保证大麦垛通风效果，在国麦生产时可以先生产水分高的国麦，避免在储存过程中大麦发霉变质，进而影响啤酒的安全性。
通过对国产大麦储存情况的检查发现，水分偏高的国产大麦在储存过程中麦温会升高，影响大麦的发芽力和发芽率，甚至导致大麦发霉变质，严重影响制麦质量。所以我们对水分高大麦垛的温度监控进行了研究，最终找出了在大麦垛埋测温电缆，对大麦垛的温度进行时时监控的措施。使用测温电缆可以对大麦垛温度升高，可能导致发霉变质的情况提前进行预警，避免了因大麦发霉变质造成的经济损失。
4.2.2国产大麦发芽率的管理
1. 使用快速检测方法检测国麦5d发芽率。发芽率≥90%码放在同一大麦垛；80%≤发芽率＜90%码放在同一大麦垛；发芽率＜80%必须分货位单独码放。
2. 单独码放的货位其实际5d发芽率检测结果出来后：发芽率≥90%码放在同一大麦垛；80%≤发芽率＜90%码放在同一大麦垛；发芽率＜80%码放在同一大麦垛，并做退货处理。
通过对发芽率的管理有效地减少了不合格品的产生。
4.2.3国产大麦蛋白质的管理
国麦蛋白质≤13%码放在同一大麦垛；蛋白质＞13%码放在同一大麦垛。麦芽生产时可以根据大麦的不同蛋白质采取不同的制麦工艺，减少不合格品的产生。
4.2.4其它指标的管理
由于不同产地和品种的国产大麦质量相差悬殊，所以国产大麦必须分品种和产地（甘肃、内蒙古和新疆等）进行码放。外观有明显霉变和异味必须单独码放并做退货处理；千粒重＜32g必须单独码放并做退货处理。保证了国产大麦的安全性和质量。
4.3麦芽生产的质量安全管理体系
4.3.1流程
不同合同或提单的大麦进厂后我们首先取样送科研中心进行品种鉴定。确定品种后，我们根据以往该品种大麦的制麦特性设计不同方案进行0.7kg/批的小试。小试结果出来以后我们根据小试结果间歇进行2～5批大生产试验。选择最优的大生产工艺进行大生产，保证麦芽质量。
4.3.2麦芽生产过程中质量安全管理
对于外观明显发暗的国产大麦优化浸麦工艺，进行较彻底的清洗和杀菌，防止霉菌和杂菌在发芽阶段大量繁殖，影响麦芽的质量。通过大量实验和统计分析研究制定出不同品种，不同产地和不同质量的国产大麦采取不同的制麦工艺，提高了麦芽质量，并有效减少不合格品的产生。
5小结
在本项目的开发过程中，我们以技术创新、管理创新为基础进行了新技术的组合研究，通过对新方法的开发和新技术的创新，使得国产大麦的质量控制指标进一步完善，在啤酒大麦国产化的大趋势下，为啤酒厂采购和使用好国麦建立一套完整的体系去评价国产大麦和麦芽的质量。
1.采用近红外法检测大麦蛋白质和水分，测定结果与凯氏定氮法的相关性极高，说明近红外法检测大麦蛋白质和水份都具有极高的准确性，完全可用近红外法代替传统的方法。大麦发芽率的RVA快速检测方法，利用了大麦糊化参数与大麦发芽率之间的相关性。该两种方法的应用，实现了大麦的快速、大批量检测，使蛋白质和水份的检测缩短到2min，发芽率的检测缩短至15min，大大缩短了检测时间，且使检测实现仪器化，减少了化学试剂的使用，大大降低了检测成本，保护了环境。为企业使用国产大麦提供充分的数据保证，起到了很好的经济效益和环保效益。
2.利用蛋白质“指纹”图谱技术鉴定大麦品种和纯度的方法，收集了纯度较高的国麦品种（目前已经有20余种），建立了国产大麦的蛋白质“指纹”图谱标准数据库。纯度检测：样品纯度>90%；品种检测：醇溶蛋白特性与相应品种标准蛋白性质吻合，且遗传特性稳定。将该数据库应用于进口大麦及国产大麦的采购中，制定出燕京原料大麦采购的检测方法和质量判定标准。
3.对我国四大产区的啤酒大麦和国外进口大麦进行脱氧雪腐镰刀菌烯醇的抽样检测，所测样品中的DON的含量范围远远低于DON的限量标准。由检测结果可知,江浙、东北和云南产区大麦中的DON含量较高一些,而西北产区、加拿大和澳洲大麦中的DON含量较低一些，主要可能是气候的原因，因为江浙、东北和云南地区气候较为湿润,有利于真菌的生长。而西北、加拿大和澳洲气候较为干燥。这为我们大麦的采购提供了一定的依据。
4.我们对国产甘啤、盐啤、临啤、垦啤、苏啤、东北大麦、科隆大麦、凤大麦、鄂大麦、新疆大麦、宁夏大麦和单二大麦等12个品种和进口大麦盖得那、宝黛、哈灵顿和艾斯特拉进行了黄曲霉毒素B1的检测，检测结果全部未检出。我们意识到这些有害物质的存在，加大监测力度，保证人类健康发展，对我们大麦的采购也提供了一定的依据。
5.我们对2006-2007年进厂的大麦进行霉菌检测。整体检测情况表明进口大麦霉菌污染情况明显好于国产大麦，国产大麦中霉菌污染严重的是西北国麦，甘肃大麦等, 国产东北大麦霉菌污染都低于其它产地的国麦。这对我们大麦的采购与使用也提供了依据。
6.通过建立和完善了啤酒大麦/麦芽质量安全体系，有效地避免了2008年的国产大麦在储存过程中发霉变质，在麦芽的生产过程中有效的减少了不合格品的产生，提高了麦芽质量，保证了啤酒生产的主要原料优质、安全、可靠，同时减少了大量经济损失。
该研究的开展不但可以保证采购的大麦满足加工要求，在大麦的贮存时避免因水分偏高导致大麦发霉变质，从而影响大麦的质量和安全，在麦芽生产时可以明显提高麦芽质量。而且还可以使大麦种植户明确企业的需要，从而引导国产大麦产业向更良性的方向发展。
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